凍存通常是指將細胞冷凍儲存在-196℃的液氮中。如在不加任何保護劑的情況下，直接對細胞加以?xún)龃?，?huì )導致細胞內、外的水分迅速形成冰晶，進(jìn)而對細胞結構與功能造成一系列的損害，如機械損傷、蛋白質(zhì)變性、電解質(zhì)升高等，最后可引起細胞死亡。為了避免細胞內冰晶的形成，在凍存細胞時(shí)常向培養液中加入適量的二甲亞砜（DMSO），因其相對分子質(zhì)量較小而溶解度大，較易穿透進(jìn)入細胞中，使細胞內冰點(diǎn)下降，并可提高細胞膜對水的通透性，配合以緩慢冷凍的方法，可使細胞內的水分逐步地滲透出胞外，避免了冰晶在細胞內大量的形成。

      復蘇是指將凍存的細胞從-196℃的液氮中取出融解，使其活力恢復的過(guò)程?？焖偃诨氖侄慰梢员ＷC細胞外結晶在很短時(shí)間內融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞重新結晶對細胞造成損害。復蘇成功的細胞可以保持很高的活力。

細胞的凍存：

1.用0.25%胰蛋白酶溶液消化處于對數生長(cháng)期的單層培養細胞，收集消化的細胞于15mL離心管中；

2.800-1000rpm離心5min，棄上清；

3.加入適量?jì)龃嬉海ò侔牟o(wú)DMSO細胞凍存液），用吸管吹打細胞制懸，調整細胞密度為5×106-1×107個(gè)/mL；

4.每個(gè)凍存管分裝細胞懸液1mL，旋緊凍存管的蓋；

5.在凍存管上標明細胞的名稱(chēng)、凍存時(shí)間、凍存人名等；

6.將凍存管置于如下條件下逐步加以?xún)龃妫?80℃，12h→液氮；

7.若使用含10%DMSO和10%FBS的培養液凍存細胞，則將凍存管置于如下條件下逐步加以?xún)龃妫?℃，1h→-20℃，2h→-80℃，12h→液氮。

細胞復蘇和活率測定：

1.用止血鉗從液氮罐凍存盒中取出細胞凍存管1只，迅速將其置入37℃水浴中，不斷搖動(dòng)使凍存的細胞懸液盡快融化；

2.用酒精棉球擦拭凍存管，放入超凈工作臺中；

3.將已融化的細胞懸液用吸管移入離心管中，加10倍體積的RPMI 1640培養基（含10%小牛血清），吹打混勻；

4.800-1000rpm離心5min，棄上清液；

5.加入培養液吹打沉淀的細胞，使其懸浮，將細胞懸液與0.4%的臺盼藍溶液以9:1的比例混合。?在室溫下染色3-5分鐘，對細胞進(jìn)行計數，計算活細胞比例；

6.按1×105個(gè)mL的細胞濃度，將細胞接種在培養瓶中，置于培養箱中培養；

7.24h后取出培養瓶，觀(guān)察細胞生長(cháng)狀況。

注意事項：

1.對數期的細胞增殖能力強，凍存后生存率較高，因此，在進(jìn)行細胞凍存時(shí)，應盡量選擇處于此期的細胞加以?xún)龃妫?/span>

2.為了保證凍存的質(zhì)量及復蘇后細胞的存活率，凍存時(shí)應掌握好消化時(shí)間，消化過(guò)度將對細胞造成損傷，復蘇時(shí)細胞難于存活。此外，復蘇后接種時(shí)，細胞的濃度不能太低，最好控制在1×105-5×105個(gè)/mL，這樣才能保證復蘇成功；

3.凍存管的管蓋應封蓋嚴密，以免復蘇時(shí)細胞外溢；

4.復蘇時(shí)，從液氮取出凍存管到水浴中融化的過(guò)程要快，否則將會(huì )導致冰晶的形成，傷害細胞。同時(shí)，一次復蘇的凍存管數量不要太多，否則會(huì )引起水浴鍋中傳熱不佳，延緩凍存的細胞懸液融化的時(shí)間；

5.為防止液氮凍傷，在復蘇過(guò)程中應戴上棉質(zhì)手套。

細胞增殖情況：

                             24h貼壁狀態(tài)                                                                                               48h增殖情況                                                                             72h增殖情況（細胞匯合度達90%）